什么時(shí)候需要緩沖溶液
在反相色譜分析中，流動(dòng)相的pH值一般在2-7之間，當(dāng)分析物在反相條件下可離解，或樣品的pH值在2－7之外時(shí)，就需要緩沖液，在反相條件下可離解的化合物一般有氨基和羧基，他們的pKa在1－11之間，選擇正確的緩沖液pH值可保證可離解的官能團(tuán)處于一種形式，離子形式或中性化合物的形式；如果樣品的pH值對(duì)柱子有傷害，則緩沖溶液可使其變溫和或減小其危害，常規(guī)硅膠基質(zhì)色譜柱的pH耐受范圍2-8。
如何選擇緩沖液pH值
在選擇緩沖液pH值之前，應(yīng)先了解被分析物的pKa，高于或低于pKa兩個(gè)單位的值，有助于獲得良好的峰形，溶液PH值高于或低于兩個(gè)pKa兩個(gè)單位，化合物99％以一種形式存在。一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳的峰。
如何確定適當(dāng)?shù)膒H適用范圍(僅適用于反向色譜法分析離子化合物方法開(kāi)發(fā)中流動(dòng)相pH的確定)
一.考察離子化合物的pKa值
在反相色譜分析中通常不要求化合物精確的pKa值，我們可以通過(guò)查閱文獻(xiàn)或者根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)按照下圖中列出的主要酸堿官能團(tuán)在水溶液的pKa值進(jìn)行推測(cè)
注意：按照上表中官能團(tuán)進(jìn)行估算時(shí)分子中相鄰基團(tuán)的不同會(huì)導(dǎo)致pKa出現(xiàn)1-2個(gè)單位的差異。對(duì)于酸性化合物，當(dāng)含有吸電子基團(tuán)時(shí)會(huì)導(dǎo)致酸性增強(qiáng)，pKa值相應(yīng)降低；對(duì)于堿性化合物，當(dāng)含有吸電子基團(tuán)時(shí)會(huì)導(dǎo)致堿性降低，pKa值相應(yīng)降低。
二.根據(jù)化合物pKa值推測(cè)流動(dòng)相相應(yīng)使用的pH
先看下流動(dòng)相pH對(duì)酸堿化合物的影響：
流動(dòng)相pH對(duì)不同pKa化合物的保留時(shí)間的影響
根據(jù)這幅圖，我們可以看出，當(dāng)流動(dòng)相的pH約等于化合物的pKa時(shí)，可以限度的調(diào)整化合物的保留時(shí)間。此時(shí)改變0.1個(gè)單位的pH可以使得保留因子k變化10%，可引起分離度±2.5個(gè)單位的變動(dòng)。但此時(shí)需要進(jìn)行精確控制流動(dòng)相的pH，這要求把流動(dòng)相pH控制在0.02個(gè)單位以?xún)?nèi)，在實(shí)驗(yàn)室很難控制，重現(xiàn)性較差，成為分析的瓶頸。
但我們實(shí)驗(yàn)時(shí)可以將pH范圍放寬，只要將流動(dòng)相pH控制在化合物pKa值±1.5個(gè)單位的范圍內(nèi)（上圖所示的II范圍內(nèi)）就可以對(duì)化合物保留行為產(chǎn)生比較明顯的影響，此時(shí)進(jìn)行分離選擇性較好。同時(shí)為了更好地控制保留行為的重現(xiàn)性，需要控制緩沖液的pH在±0.1個(gè)單位以?xún)?nèi)(當(dāng)流動(dòng)相pH控制范圍較窄時(shí)建議使用緩沖鹽的質(zhì)量進(jìn)行控制，比pH計(jì)進(jìn)行控制效果更優(yōu))。
通過(guò)以上三點(diǎn)分析我們可以得出，待分析化合物的pKa與確定流動(dòng)相的pH有很大的關(guān)系。主要依據(jù)化合物出峰時(shí)間、化合物的峰型及所需要分離目標(biāo)的化合物綜合考慮來(lái)確定流動(dòng)相的pH。
可能有人會(huì)發(fā)現(xiàn)第二點(diǎn)和第三點(diǎn)是有些矛盾的，這時(shí)候就需要對(duì)自己的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步的探索，看看是否pH值會(huì)對(duì)化合物的峰型產(chǎn)生影響（有的專(zhuān)家認(rèn)為該觀點(diǎn)缺乏理論和實(shí)踐的支持）或者是否需要準(zhǔn)確調(diào)節(jié)pH在化合物pKa±1.5范圍內(nèi)進(jìn)行提高選擇性。
在做實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)有的物質(zhì)會(huì)因稀釋液pH使用不當(dāng)產(chǎn)生峰分叉的現(xiàn)象，調(diào)節(jié)稀釋液的pH即可解決峰的分叉；有時(shí)流動(dòng)相pH在化合物的pKa±2的范圍內(nèi)時(shí)離子化合物并沒(méi)有出現(xiàn)峰分叉、峰型不好現(xiàn)象。
三.根據(jù)流動(dòng)相pH值測(cè)定所需要的緩沖鹽
1.緩沖液選擇主要依據(jù)：
（1）緩沖溶液的pKa和緩沖容量
（2）溶解度
（3）紫外吸收
2.對(duì)以上三點(diǎn)進(jìn)行說(shuō)明
(1)一般緩沖溶液的pKa值與流動(dòng)相的pH相等時(shí)緩沖能力很大，pKa與流動(dòng)相的pH相差越大，緩沖液的緩沖能力越差。一般要求流動(dòng)相的pH與緩沖液的pKa值不能超過(guò)±1.0個(gè)單位，當(dāng)緩沖溶液濃度較高時(shí)可以放寬范圍到1.5個(gè)單位。常用的緩沖液的緩沖范圍見(jiàn)下圖：
緩沖溶液的濃度一般在5-50mmol，因過(guò)低導(dǎo)致緩沖能力不足（可通過(guò)調(diào)整進(jìn)樣體積查看化合物峰型的變化，如果出現(xiàn)拖尾或者前沿現(xiàn)象，說(shuō)明緩沖溶液的能力不足）；緩沖液濃度過(guò)大會(huì)導(dǎo)致與有機(jī)相混溶時(shí)鹽的析出，對(duì)儀器、色譜柱都會(huì)產(chǎn)生損傷，而且使得基線(xiàn)不好。一般初始摸索方法時(shí)推薦使用25mmol。
（2）根據(jù)緩沖液溶解度：在酸性緩沖溶液中，如磷酸鹽，緩沖液溶解度順序：鈉鹽＜鉀鹽＜銨鹽；有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH=7時(shí)10mmol的磷酸鉀在85%甲醇或者75%乙腈中可以溶解，在pH=3時(shí)，在85%甲醇或者85%乙腈中可以完全溶解（此測(cè)試通過(guò)使用容器將不同比例的混合溶劑進(jìn)行混合，觀察大約30min，是否有沉淀產(chǎn)生，否則就要降低緩沖液的濃度或者有機(jī)相的含量，在梯度洗脫時(shí)尤為注意）。
（3）根據(jù)化合物的吸收波長(zhǎng)：在pH≤3.5，6.0≤pH≤8.5或者pH≥11.0磷酸鹽緩沖液是不錯(cuò)的選擇。而甲酸鹽和乙酸鹽緩沖液的范圍是2.5～6.0，適用于210納米或者更高吸收的檢測(cè)波長(zhǎng)。
3. 緩沖鹽的作用：
緩沖鹽的種類(lèi)或者濃度對(duì)選擇性的改變會(huì)很小，只是起到緩沖作用，提高化合物的保留時(shí)間的穩(wěn)定性。
高效液相色譜法中選擇緩沖鹽的注意事項(xiàng)
在高效液相色譜法中，分離酸或堿緩沖溶液對(duì)維持流動(dòng)相恒定pH和提高保留時(shí)間的重現(xiàn)性都非常重要。
怎么選擇緩沖液：
Pka和緩沖容量
溶解度
紫外吸光度（使用UV檢測(cè)器）
揮發(fā)性（MS蒸發(fā)光散射檢測(cè)器）
離子對(duì)性質(zhì)
穩(wěn)定性和儀器的兼容性
根據(jù)以上的理論，流動(dòng)相緩沖容量取決于緩沖鹽的pka，緩沖鹽濃度，流動(dòng)相pH。
當(dāng)緩沖液中溶質(zhì)的的兩種形態(tài)（HA和 A-）濃度相等時(shí)，即緩沖鹽的pka與流動(dòng)相pH相等時(shí)，緩沖能力很大。當(dāng)流動(dòng)相的pH與緩沖鹽的pka相差越大，緩沖鹽的緩沖容量就越小。因此緩沖的pka與流動(dòng)相的pH相差不能超過(guò)±1.0個(gè)單位。
流動(dòng)相的緩沖容量一般與緩沖液濃度成正比關(guān)系，通常濃度范圍為5~25mmol/l。
樣品溶解在流動(dòng)相中可以避免在反相色譜過(guò)程中發(fā)生緩沖能力的問(wèn)題，尤其是流動(dòng)相緩沖液濃度較低或注入樣品量較大的時(shí)候尤為重要。
當(dāng)緩沖容量偏低時(shí)，可以從以下方面調(diào)節(jié)緩沖容量：
1、減少緩沖液pKa與流動(dòng)相pH之間的差異（可調(diào)節(jié)pH或更換緩沖液）
2、礦大流動(dòng)相pH和溶質(zhì)pKa之間的差異（當(dāng)差異足夠大時(shí)，溶質(zhì)倍完全離子化或者保持非離子化形式此時(shí)緩沖液顯的不重要了）
3、增加緩沖液濃度
4、減少樣品進(jìn)樣體積
5、調(diào)節(jié)樣品的pH與流動(dòng)相的一致。
